A directed approach for the identification of transcripts harbouring the spliced leader sequence and the effect of trans-splicing knockdown in Schistosoma mansoni

Schistosomiasis is a major neglected tropical disease caused by trematodes from the genus Schistosoma. Because schistosomes exhibit a complex life cycle and numerous mechanisms for regulating gene expression, it is believed that spliced leader (SL) trans-splicing could play an important role in the biology of these parasites. The purpose of this study was to investigate the function of trans-splicing in Schistosoma mansoni through analysis of genes that may be regulated by this mechanism and via silencing SL-containing transcripts through RNA interference. Here, we report our analysis of SL transcript-enriched cDNA libraries from different S. mansoni life stages. Our results show that the trans-splicing mechanism is apparently not associated with specific genes, subcellular localisations or life stages. In cross-species comparisons, even though the sets of genes that are subject to SL trans-splicing regulation appear to differ between organisms, several commonly shared orthologues were observed. Knockdown of trans-spliced transcripts in sporocysts resulted in a systemic reduction of the expression levels of all tested trans-spliced transcripts; however, the only phenotypic effect observed was diminished larval size. Further studies involving the findings from this work will provide new insights into the role of trans-splicing in the biology of S. mansoni and other organisms. All Expressed Sequence Tags generated in this study were submitted to dbEST as five different libraries. The accessions for each library and for the individual sequences are as follows: (i) adult worms of mixed sexes (LIBEST_027999: JZ139310 - JZ139779), (ii) female adult worms (LIBEST_028000: JZ139780 - JZ140379), (iii) male adult worms (LIBEST_028001: JZ140380 - JZ141002), (iv) eggs (LIBEST_028002: JZ141003 - JZ141497) and (v) schistosomula (LIBEST_028003: JZ141498 - JZ141974).

O uso das etiquetas de sequências trancritas na identificação de genes de schistosoma mansoni / The use of the labels of trancritas sequences in the identification of genes from Schistosoma mansoni

Em Schistosoma mansoni calcula-se que existam, pelo menos, 15.000 genes expressos, distribuídos em 270 Mb de genoma. No entanto, menos de 0,1 por cento desta informação genética e atualmente conhecida, justificando-se a adoção de um programa de seqüenciamento em larga escala para o parasita. Este programa visa aumentar 0 conhecimento atual sobre a fisiologia do S. mansoni e em ultima instancia identificar alvos da resposta imune, sítios para a ação de quimioterápicos, ou para a intervenção dos processos de desenvolvimento, maturação sexual e oviposição. O projeto e baseado na produção de Etiquetas de Seqüências Transcritas (ESTs), que consistem de seqüências parciais de cDNA, que são suficientes para a identificação do mesmo, baseado em homologias com seqüências depositadas em bancos de dados. Ate o momento nos produzimos 804 ESTs derivadas do seqüenciamento de 615 clones de cDNA. Oestes clones, 111 possuíram homologia com genes previamente descritos no parasita; 158 foram identificados por homologia com genes de outros organismos; 206 não possuíram homologia com qualquer seqüência nos bancos de dados; 40 não puderam ser identificadas por possuírem apenas homologias parciais com genes de distintos organismos e 0 restante consistiu de seqüências não úteis (vetores sem inserto, rRNA, ONAmt e um gene contaminante). Em ultima analise, 05 515 clones úteis correspondem a 213 genes distintos, sendo 20 genes previamente caracterizados em S. manson; e 193 genes novos do parasita. O numero de genes novos por nos obtido corresponde a quase o dobro do numero de genes do parasita anteriormente presente nos bancos de dados, enfatizando a importância deste tipo de projeto para o conhecimento do conteúdo de genes expressos pelo organismo. Estamos também utilizando ESTs como marcadores para a construção de um mapa físico do genoma do parasita. As ESTs são hibridizadas contra bibliotecas ordenadas de YACs e cosmídeos em filtros de alta densidade, de forma que 05 clones positivos são utilizados na montagem dos "contigs" e posterior localização em cromossomos metafísicos par Supressão da Hibridização Cromossomica in situ (CISS). Finalmente, iniciamos um programa de estudo de alguns genes que foram identificados pela estratégia das ESTs. Fizemos assim a seqüenciamento completo dos cDNAs que codificam a proteína que se liga ao elemento Y-box (smyb1) e a proteína conservada básica de mama 1/proteína ribosomal L13 (smbbc1/rI13). Para estes dais genes, alem da seqüência completa dos cDNAs, foram produzidas seqüências genomicas parciais e foi feita a sua localização em cromossomos metafásicos. Foram realizados também estudos da expressão gênica em diversas fases do cicio de vida do animal par RT-PCR, assim como estudos de modelagem computacional, para a gene smyb1, a que nos levou a sugerir uma possível estrutura tridimensional para a proteína par ele codificada.